KOD -Multi & Epi-^®

多重PCR

亚硫酸氢盐处理的DNA的扩增

●均一地扩增（低偏差）
可以在1 kb以下的短片段至10 kb左右的长链目的片段这一广范围内进行高特异且均一性的多重PCR。将因GC偏差引起的对扩增的影响降到了最低程度、可均一地扩增基因组及转录组的各种区域的片段。

利用这一特性，可制备用于下一代测序分析的扩增产物。

●含有较多尿嘧啶DNA的扩增

可对亚硫酸氢盐处理后的含有较多尿嘧啶的DNA进行高效率地扩增。已确认最大可扩增约1.5 kb。

●可使用含有I或U的引物

以前的高保真性PCR酶，使用含有I或U的引物时扩增困难，KOD -Multi & Epi- 则可以使用这类引物进行分析。

●高保真性　

是Taq polymerase保真性的11倍（与KOD FX Neo相同），扩增产物可用于各种用途。

●可扩增粗样品

不易受粗样品的影响，比如使用血液样品，还可对动植物的裂解物进行基因分型，甚至对土壤、食品样品等进行扩增。

●高效率　

因为添加了延伸增强剂，提高了PCR效率，单重PCR最短延伸时间可以缩短到15 sec./ kb。

※粗样品、使用亚硫酸氢盐处理的DNA样品及进行长链多重PCR时，为了提高效率，延伸时间推荐设为30~60 sec./ kb。

1. 多重PCR性能比较

使用纯化的人基因组DNA及血液样品，对1kb以下及1~10kb的多数的目的片段，用各种PCR酶进行多重PCR性能的比较（50ul反应体系）。结果显示，只有使用KME时，才能在所有的条件下得到偏差性低的良好结果。KME不易受血液成分的抑制，可以得到与用纯化的基因组DNA扩增相同的偏差小的扩增结果。

2. 使用NGS对长链（10kb）目的片段的多重扩增时偏好性的验证

用6种PCR试剂对10种10kb的目的片段（其中5种目的片段的GC含量在70%的区域含有300bp以上的长度）进行扩增，将确认能扩增的试剂的PCR产物纯化后用Covaris^®片段化，使用Truseq^® nano LT kit制备文库，使用Miseq^®(illumina)进行测序分析。以Read数最多的目的基因为基准（1.0），将各个Read数的比值作成图。

电泳结果显示，虽然泳道3，5中用A公司的试剂也得到了良好的扩增，但是NGS分析的结果中，产生了扩增偏好性。另一方面，KME在10种目的基因中，因为Read数的比值在0.6~1.0之间，可见均一性良好。

3. 亚硫酸氢盐处理过的DNA的扩增效率的比较

没甲基化的C用亚硫酸氢盐处理后转变成U，通过PCR测序分析，就可以与甲基化的C区别开。通过这样处理，目的片段序列中的AT含量变高，另外因为被片段化后，通常亚硫酸氢盐处理过的DNA的扩增比较困难。

以亚硫酸氢盐处理过的Jurkat细胞来源的甲基化DNA（55ng）为模板，用各种DNA聚合酶扩增900~1500bp的片段进行比较。结果显示，大约1.5kb以内的目的片段，用KME都能得到一个良好的扩增结果。然后进一步对于1583bp的扩增产物，使用克隆试剂盒（Target Clone-Plus-）进行克隆之后，进行测序分析，可以确认亚硫酸氢盐处理过的目的片段也得到了扩增（数据没有在此出示）。

另外，对于TGF (917bp)，进行模板量的探讨。结果显示，可以检测到最低5ng的量。通过亚硫酸氢盐处理可以使DNA片段化，KME对于这样处理过的样品，也可以高灵敏度地检测到约1kb的目的片段。

4. 含有次黄苷酸（I）的引物扩增效率的比较

根据E.coli 的DNA聚合酶Ⅰ的氨基酸序列设计含次黄苷酸（I）的兼并引物，用KME和KOD-PLUS- Ver.2（原来的产品）进行扩增。

结果显示，通过使用KME，可使用用原来的KOD DNA聚合酶等高保真性PCR酶不能使用的含有I的兼并引物进行扩增。同样也可使用含U的引物进行扩增。