Ligation high

用途

DNA连接

说明

本试剂是以T4 DNA Ligase为主体的高效率单管型连接试剂，广泛应用于各种末端DNA的连接反应。通过组分条件的优化，使之对冻结/融解的稳定性和反应效率大大提高。是含有连接反应所需要的rATP・DTT等的单管连接试剂。使用时只需按DNA样品溶液的1/2〜同等量加入Ligation high，就可以得到比单独使用T4 DNA Ligase更好的结果。

特征

●简便
只需在DNA样品中混入Ligation high，便可进行高效率的连接反应。

●高效率
与单独使用T4 DNA Ligase相比，可获得50倍以上的效率。

●高稳定性
经实验确认，即使反复冻融50次，也不会降低连接反应的效率。

实验例

1.反复冻融时的稳定性

冻融后，按推荐说明书进行连接反应。结果表明：即使反复冻融50次，也不会降低连接反应的效率。

2. 盐浓度的影响

本实验探讨DNA溶液中所含的盐（NaCl）浓度对连接效率的影响。 将用SacⅠ切断的pBluescript®Ⅱ（5ng）混入不同盐浓度的TE Buffer 5μl中，以观察DNA溶液中所含的盐成分对自连接效率有多大影响。方法如下：在DNA 片段溶液中添加与其等量或一半量的Ligation high，16℃条件下反应30min.，取2μl用于转化，检测出现的菌落数。 结果显示，NaCl浓度越高，连接反应效率越低。 因此，对溶解在限制酶H Buffer等高盐浓度反应液的DNA用于连接反应时，建议先置换成TE buffer。

3.反应时间对PCR产物TA克隆的影响

使用本试剂，将PCR产物插入到T载体中，观察反应时间对实验的影响。实验方法如下：先以λDNA 500bp为目的片段，用rTaq DNA Polymerase进行。将该反应液1μl (约6.4ng)和2μl的T载体(50ng)添加到3μl的Ligation high中，在16℃条件下进行不同时间的温育，再进行连接反应。然后再用各反应液2μl进行大肠杆菌转化，测定白斑和蓝斑的数量。 结果显示，反应时间越长，效率越高，16小时效果最好。2小时以上，蓝斑的数量没有明显变化，而时间越长白斑的数量越多。因此，用Ligation high进行PCR产物的TA克隆时，如想要获得高插入率，建议反应时间在2小时以上，最好是16小时。

※想在短时间内进行TA克隆时，推荐使用Ligation high Ver.2。 

4. 反应时间的探讨

用λ/HindⅢ酶切，用Ligation high在16℃条件下进行不同长度时间的连接反应，EtOH沉淀后进行电泳。 结果可见，HindIII酶切末端，约5min.即可完成充分的连接反应。