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Code No. 包装 价格 保存温度 说明书
LGK-201 750μl×1支 RMB 750 -20℃ 产品说明书

用途

DNA连接

说明

本试剂是以T4 DNA Ligase为主体的高效率单管型连接试剂，广泛应用于各种末端DNA的连接反应。通过对原产品进行改良，可简便地用于各种用途。本试剂是在原产品『Ligation high』基础上改良的使用更方便的高效率单管型连接试剂。只需与DNA片段混合，进行短时间反应，即可高效率地进行连接。可广泛用于突出末端、平滑末端及TA克隆等方面。



特征

●高效率  
特别是TA克隆效率得到了大幅度的提高。下图是用各公司试剂盒对TA克隆效率的比较。





●即使在-20℃保存也不会冻结
从冷冻柜中取出后可立即使用。右图表示-20℃保存时试剂的状态[原来的产品:Ligation high〈绿〉、本产品:Ligation high Ver.2〈蓝〉]。  




●简便的单管型

使用方法与原有产品一样，只要将试剂和DNA片段混合即可，非常简便。




实验例

1.DNA末端形状与连接效率的关系



在16℃条件下反应时，将DNA片段（0.5kb）的克隆效率与末端形状进行比较。结果可见，突出末端的连接约5分钟即可完成，而平滑末端及TA克隆30分钟约完成70〜80%。另外，平滑末端克隆及TA克隆时间超过1小时，到2小时为止，连接效率会逐渐提高。因此当克隆效率比较低时，可将反应时间提高至2小时左右可提高连接效率。





2.使用未经纯化的PCR产物的TA克隆


 将T载体（50ng, 25fmol）和具有良好扩增效率的未纯化PCR产物（用Taq DNA polymerase扩增的0.5kb片段）按照各种比例混合，在该DNA溶液〈7.5μl〉中添加Ligation high Ver.2〈7.5μl〉，在16℃条件下反应30分钟。然后，用10μl反应液对E. coli DH5α感受态细胞〈100μl〉进行转化，用LB/Amp（X-Gal）培养基培养后点克隆数。结果可见，尽量少带入PCR反应液可得到良好的结果。　由于用纯化后的DNA片段可得到高效率，因此当效率低下时，可使用纯化后的PCR产物。 



产品内容

  • Ligation high Ver.2    750μl



    ※1次使用7.5μl时，可使用100次。



    注意事项

    • ●在−30℃以下长期保存，或在冷冻柜的冷气出风口处保存时，可能会产生冻结现象。经实验证明，5次反复冻融不会影响试剂活性，但注意请尽量不要使其冻结。产生冻结时，可用手指捏着离心管使其融解，但注意不要使其升温。


      ●产生白色沉淀时也可按照上述方法将沉淀溶解后正常使用。



      基本反应条件

      • 载体+插入DNA    7.5μl

        Ligation high Ver.2  3.75～7.5μl*

        ↓

        16℃、30min.

        ↓

        向100μl的Competent cell中加入大约10μl的反应溶液，进行转化。



        *TA克隆时，用7.5μl进行反应。



        ※在用电穿孔法进行转化时，请将反应液进行脱盐或乙醇沉淀法对DNA进行纯化。



        几点建议

        ●反应时间
        一般推荐16℃、30分钟，但普通的突出末端连接通常只需5分钟即可完成。当平滑末端或TA克隆的反应效率低下时，将反应时间延长至2小时左右通常可提高连接效率。实验例1中有关于反应时间的数据。


        ●反应液带入
        盐的带入会影响到连接反应。在TA克隆时，未经纯化的PCR产物的带入为0.5〜1μl（15μl反应体系）时，可获得很高的连接效率。使用MagExtractorTM -PCR & Gel Clean up-进行纯化，TA克隆可获得更高的效率。

         
        ●TA克隆效率
        如想获得更高的连接效率，可使用磷酸化的引物进行PCR。


        参考文献

        1)R. L. Hawkins et al., Current Microbiol., 38: 335-341(1999)

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        ●高效率DNA片段抽提试剂盒

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