<实验目的>
可确认无需从丝状菌・酵母的菌体抽提、纯化即可进行DNA的扩增。
<实验方法>
【样品的种类】
Aspergillus oryzae 及 Saccharomyces cerevisiae 菌体
【样品的制备方法】
用牙签从丝状菌・酵母生物的培养板挑菌，以以下制备物为模板。
1. 50μl的灭菌水悬浊液中取 5μl
2. 20μl的灭菌水悬浊液中取 5μl
3. 直接PCR 
【基因名称与目的片段长度】
18S rRNA的 ITS1区域
Aspergillus oryzae : 约180bp
Saccharomyces cerevisiae : 约450bp
【引物序列】
ITS1 Forward Primer : GTAACAAGGTYTCCGT
ITS1 Reverse Primer : CGTTCTTCATCGATG
※目的片段比较短，所以本实验中使用的引物比推荐长度(22～35mer)更短的引物。
【反应液组分】 【PCR循环】
(μl)
灭菌蒸馏水 3.8 或 8.8 98℃ 10sec.
KOD OneTM PCR Master Mix 10 45℃ 5sec. 30cycles
10μM Forward Primer 0.6 68℃ 10sec.
10μM Reverse Primer 0.6
Template 5 或菌体
--------------
Total 20
<点评>
使用Saccharomyces cerevisiae时，样品制备方法不同，虽然未能看到扩增量的差别，但在使用Aspergillus oryzae 时，直接将悬浊菌液加入到PCR反应液中时扩增很好。另外，分别用KOD OneTM PCR Master Mix和KOD OneTM PCR Master Mix -Blue-扩增时，结果没有差别。
※对菌体的直接PCR，虽然菌体量过多时会产生抑制作用，导致不能扩增，但另一方面，霉菌等细胞因为比较坚固，如果不加入足够的量，则有可能也不能扩增。所以推荐事先进行一下菌体添加量的优化。
进行菌体量优化也不能扩增时，可将延伸时间设定为10sec./kb，可能会扩增。
另外，使用KOD OneTM PCR Master Mix 时，推荐的PCR循环中不包括预变性这一步，所以进行样品制备时，用灭菌水悬浊后，进行95℃, 5min.左右的热处理，不同菌种，有时PCR效率也不同。
产品搜索
内容
