数据提供 : 札幌医科大学 医学部 分子生物学讲座 新沼 猛
<实验目的>
基因克隆目的的PCR
< 实验方法>
【样品的种类】
HUVEC cDNA
【样品的制备方法】
使用从培养的细胞抽提的RNA 500ng，用ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover(Code No. FSQ-301)进行cDNA的合成。
【目的片段长度】
大约2,200 bp
【引物】
Forward Primer : 长度 : 30 mer Tm: 84 ℃
Reverse Primer : 长度 : 29 mer Tm: 72 ℃
■KOD One® PCR Master Mix
【反应液的组成】 【PCR循环】
(μL)
灭菌蒸馏水 9.75 98℃ 10sec. 35cycles
KOD One® PCR Master Mix 12.5 60℃ 5sec.
10μM Forward + Reverse Primer 0.75 68℃ 20sec.
Template (HUVEC cDNA) 2
Total Volume 25
■A公司 高效率PCR 酶
【反应液的组成】 【PCR循环】
(μL)
灭菌蒸馏水 17.65 98℃ 10sec. 35cycles
10×PCR Buffer 2.5 60℃ 30sec.
2.5mM dNTPs 2 72℃ 120sec.
10μM Forward + Reverse Primer 0.75
PCR 酶 0.1
Template (HUVEC cDNA) 2
-----------------------------
Total Volume 25
■A公司高速·高保真 PCR Master Mix
【反应液的组成】 【PCR循环】
(μL)
灭菌蒸馏水 9.75 98℃ 10sec. 35cycles
PCR Master Mix 12.5 60℃ 5sec.
10μM Forward + Reverse Primer 0.75 72℃ 20sec.
Template (HUVEC cDNA) 2
----------------------
Total Volume 25
< 结果·讨论>
这次的PCR结果使用KOD One扩增出了基因的全长。以前用A公司的高效率PCR酶没有得到扩增，使用KOD One得到了扩增。这次，在A公司的高效率PCR酶中添加了A公司的高速・高保真 PCR Master Mix再次进行了比较，但是仍然未得到A公司高效率PCR酶、高速・高保真PCR Master Mix的扩增结果。
虽然没有提供这些数据，但是也进行了cDNA合成等几种PCR，对这些区域的扩增效率均与A公司高速・高保真 PCR Master Mix相同或更高。
<感受及建议等>
原来一直喜欢用A公司的高速・高保真 PCR Master Mix，但是现在可以用KOD One进行替换，替换后可以非常顺利地进行实验。
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