KOD One™ PCR Master Mix KOD One™ PCR Master Mix -Blue-
实验例14：基因表达载体间的替换

数据提供 : 庆应义塾大学 理工学部 生命分子工学研究室  藤原 庆

<实验目的>
分别将克隆的基因克隆到另外的表达载体。

<实验方法>
 
【样品的种类】
Plasmid DNA

【样品的制备方法】
用试剂盒提纯的DNA

【目的片段基因名称与长度】
载体A(pET15由来)
   6,050bp                   
大肠杆菌基因A-H
   1,000~2,000bp       
           
【引物序列】  
载体用

Forward Primer : 长度 : 20nt     Tm : 55.4℃

Reverse Primer : 长度 : 18nt     Tm : 56.9℃ 基因用

Forward Primer : 长度 : 23nt    Tm : 58.8℃ 

Reverse Primer : 长度 : 21nt    Tm : 53.8℃ 

【相同区域】
(本次实验中，因为引物序列中含有与替换质粒本身有相同的序列、相同的区域)
Forward : 81nt
Reverse : 117nt

【反应液的组成】                                                         【PCR循环】
  (μL)  
  灭菌蒸馏水                           1.4                               98℃  1min.  
  KOD One® PCR Master Mix            2.5                               96℃  10sec. 25cycles
  3μM Primer F                        0.5                               55℃  10sec.
  3μM Primer R                        0.5                              72℃  10-35sec.
  50ng/μL Template                 0.1    
   ---------------------
  Total Volume 5.0  

【检测仪器】ChemiDoc MP (Bio-Rad)

PCR之后，向 5μL反应液中添加DpnI(NEB) 0.1μL
     ↓
37℃ 40分钟(这期间进行电泳)

　  ↓
1.5μL Vector与1μL基因混合，再与12Μl的 iVEC3株感受态细胞混合
(使用的感受态细胞是由资源研究所提供的冻存细胞，按照protocol制作的感受态细胞)
     ↓
On ice 20分钟
　  ↓
添加LB培养基 400Μl，37℃静置60分钟
     ↓
离心(12,000xg 30秒)，回收菌体，弃上清
  　↓
用10μL的10mM Tris-HCl(pH8.0)悬浊，然后涂板
     ↓
第二天，取长出的克隆，使用KOD One进行菌落PCR(1个样品合计用3μL的反应体系)

< 结果・讨论> 
各基因产生一个克隆。8个克隆中有7个转化成功。
<感受及建议等>
使用该酶替换了其他公司的高速PCR酶，载体的扩增效率成倍提高，且载体PCR几乎没有失败的。另外，通过iVEC3方法进行基因重组，从PCR到涂板只需要2小时即可完成。