腐殖酸(humic acid)是在腐殖土或土壤中存在的红褐色或黑褐色有机物质，已知对PCR有抑制作用。用通常纯化DNA的方法不能除去腐殖酸。因此，以环境或生态样品为模板进行PCR时非常困难。
因此，使用KOD One® PCR Master Mix 及各种PCR酶，以含有腐殖酸的人基因组为模板扩增HBg基因。
【样品】 人基因组DNA
【目的片段基因名称与长度】
HBg / 1.3kb
【引物序列】
Forward Primer : TTAGGCCTTAGCGGGCTTAGAC
Reverse Primer : CCAGGATTTTTGATGGGACACG
【反应条件】
(1) 反应液的组成 (μL) (2) 循环条件
灭菌蒸馏水 Y 98℃, 10sec. 30cycles
KOD One® PCR Master Mix 10 60℃, 5sec.
10pmol/μL Primer F 0.6 68℃, 7sec.
10pmol/μL Primer R 0.6 (5sec. / kb)
OD280=1 腐殖酸 X
4ng/μL 人基因组DNA 1
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Total Volume 20
※KOD One PCR Master Mix以外的PCR酶分别用各自推荐的反应条件扩增。
【结果】
使用KOD One® PCR Master Mix时，无论添加多少腐殖酸都可以看到扩增，高速PCR条件下也可以耐受高浓度的腐殖酸。
M : 1kb DNA Ladder
腐殖酸添加量(X)：
Lane 1 : 0μL, Lane 2 : 1μL, Lane 3 : 2μL, Lane 4 : 3μL, Lane 5 : 4μL, Lane 6 : 5μL, Lane 7 : 6μL,
Lane 8 : 7μL
KOD One 实验例19
高速PCR扩增 17.5～40kb的长链目的片段
使用KOD One® PCR Master Mix 及其他公司的PCR酶，以人基因组DNA为模板扩增长链目的片段。
【引物序列】
目的片段 17.5kb Hbg
Forward Primer TGCACCTGCTCTGTGATTATGACTATCCCACAGTC
Reverse Primer ACATGATTAGCAAAAGGGCCTAGCTTGGACTCAGA
目的片段 24kb tPA
Forward Primer CCTTCACTGTCTGCCTAACTCCTTCGTGTGTTCC
Reverse Primer TGTCTCCAGCACACAGCATGTTGTCGGTGAC
目的片段 32kb Hbg
Forward Primer AGACTTCACATGCTGCTCTGTGCATCCGAGTG
Reverse Primer ACATGATTAGCAAAAGGGCCTAGCTTGGACTCAGA
目的片段 40kb Hbg
Forward Primer GTTCTCCTCTGCATATCTCCCCACCGCATCTCTTT
Reverse Primer CCTTCAGTGCCCATGATGTAGGAAAGTGTGGCATA
【反应条件】
(1) 反应液的组成 (μL) (μL) (2) 循环条件
Lane 1-3 Lane 4-8
灭菌蒸馏水 7.8 3.8 98℃, 10sec. 30cycles
KOD One® PCR Master Mix 10 10 60℃, 5sec.
10pmol/μL Primer F 0.6 0.6 68℃, 10sec./kb
10pmol/μL Primer R 0.6 0.6
10ng/μL 人基因组DNA 1 5
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Total Volume 20 20
其他公司的PCR酶按照各厂家推荐的条件进行扩增。
【结果】
可以确认，使用KOD One® PCR Master Mix 可扩增17.5~40kb的目的片段。
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