KOD FX
实验例6: 挑战扩增真核细胞最长基因DMD(13.5Kb)的PCR克隆

人dystrophin(DMD)基因是真核细胞中最长的mRNA之一。这里介绍一下使用KOD FX对该基因的全长进行克隆的例子。

逆转录反应 
1st  Strand 合成试剂盒：ReverTra Ace -α-(Code No.:FSK-100)
  RNA :Human Adult Skeletal Muscle total RNA (Code No.:CA1H60）　1μg / 20μl反应体系 
逆转录Primer: Oligo (dT)20 primer(Code No.:FSK-201)
↓
用KOD FX进行PCR
Primer F: GATGGCCTTGTTGGCCTACTGGAGCAATAAAGTTTGAAGAACTTTTACCAGG
Primer R: GACGGCCTATGTGGCCACAACACGAAATAATGTCCAAATTAATTATGC　（下划线部分为Sfi I位点）
↓
通过琼脂糖凝胶电泳确认扩增产物
↓
剩下的PCR扩增产物用MagExtractor -PCR & Gel Clean up-(Code No.:NPK-601)纯化
↓
用限制酶Sfi I(Code No.:SFI-111)消化PCR产物　
↓
琼脂糖凝胶电泳分析、切胶、DNA回收
↓
与预先用Dra III切断的Plasmid Vector pME13SFL3连接
↓
大肠杆菌感受态细胞DH5α（Code No.:DNA-903）转化
↓
对转化结果挑出5个克隆通过测序确认序列

＜结果＞  测序结果可知，在5个克隆中可得到1个由于PCR错误而没有变异的DMD基因的全长。

关于KOD FX的保真性・・・
在KOD FX的PCR过程中，产生碱基错配的频率（错误率）144,535个碱基中仅为19个，该保真性约为Taq酶或其他公司Long PCR用酶的10倍。

※KOD -Plus- Ver.2的保真性与KOD -Plus- 大致相等。
＜PCR错误率的测定方法＞以人基因组DNA为模板，用各酶对β-globin区域2.4kb进行扩增，对PCR产物进行TA克隆后，选择96个克隆进行测序，确认序列。