KOD FX
实验例25: 通过菌落PCR确认酵母重组体

以下为来自各位老师的KOD FX使用例，希望能对大家的实验有所帮助。本实验探讨以用酶处理后的酵母及酵母菌落直接作为样品的PCR。

『Zymolyase处理』

【基因名】
将Xanthophyllomyces dendrorous克隆后的产物在质粒状态下导入到
Saccharomyces cerevisiae Y187的序列4种(A-D)

【样品】
用牙签取S. cerevisiae Y187的菌落少许，
在Zymolyase溶液[Zymolyase 2.5 mg/ml、10 mM磷酸钠缓冲液pH7.5、
1.2 M山梨醇（sorbitol）]10 μl中悬浊，取37℃・30分孵育后的溶液1 μl，作为模板添加到 PCR反应液中（total 20 μl）。

【目的片段长】
约3000 bp

【引物条件】
Forward 22 mer 5’-ctattcgatgatgaagataccc-3’
Reverse 19 mer 5’-aaattgagatggtgcacga-3’

【循环】
KOD-FX: 94℃ 4 min
(98℃ 10 sec,60℃ 30 sec, 68 ℃ 4 min)×30cycles
　 4℃　∞

※其他公司酶使用其说明书推荐的条件(30cycles)。

M: 1kb DNA Ladder
公司酶
1~9: KOD FX

1: 导入了带有A序列质粒的菌落1
2: 导入了带有A序列质粒的菌落2
3: 导入了带有B序列质粒的菌落1
4: 导入了带有B序列质粒的菌落2
5: 导入了带有C序列质粒的菌落1
6: 导入了带有C序列质粒的菌落2
7: 导入了带有D序列质粒的菌落1
8: 导入了带有D序列质粒的菌落2
9: 带有B序列的质粒(从酵母中抽提・纯化)（Positive Control）

由于上述实验取得了良好的结果，因此下面继续进行菌落直接PCR(不进行Zymolyase处理)。

『菌落直接法(不进行Zymolyase处理)』

【基因名】
其他种类酵母的cDNA文库

【样品】
将导入上述cDNA文库的S. cerevisiae Y187直接添加到PCR反应液中进行悬浊。

【目的片段长】
约500~4000 bp

【引物条件】
Forward 22 mer 5’-ctattcgatgatgaagataccc-3’
Reverse 19 mer 5’-aaattgagatggtgcacga-3’

【循环】
KOD FX: 94℃ 4 min
(98℃ 10 sec,60℃ 30 sec, 68 ℃ 4 min)×30cycles
4℃　∞

M： 1kb DNA Ladder
1~21: KOD FX

【数据提供】
奈良先端科学技术大学研究生学院　细胞技能学教研室　
浮边健老师、大津严生老师、高木博史老师

【来自老师的评语】
以前我们也用过其他公司的Polymerase对酵母进行菌落PCR，但条件稍有差异（菌落的年龄、使用菌体的量等），即会出现有时可扩增，有时无法扩增的情况，很不稳定。
而自从使用『KOD FX』以来，已经进行了100多次菌落PCR，还没有出现过失败的扩增例，且无需用Zymolyase对酵母菌体进行处理（和大肠杆菌的菌落PCR同样）直接将菌体添加到PCR溶液中也能顺利地扩增。