KOD FX
实验例29: 用DGGE法对沿海生息的植物-浮游生物(隐藻cryptophyta)的多样性分析

【基因名】PsbA（光化学体系II反应中心的D1蛋白 ）
                    特别是以隐藻（Cryptophyta）为目的片段

【样品】海水性过滤膜（Millipore公司的Durapora）过滤的样品

【样品配制方法】
　 在过滤后的过滤膜里添加溶解液1ml、55℃条件下处理1小时
　 →去除过滤膜、离心（10,000×g, 10分钟）处理
　 →上清1~1.5μl作为模板使用

【片段长】约350bp

【引物序列】
Primer F：5'-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCC 
                        CCGCCCCATGCGTCCTTGGATTTCTGT -3' (60mer)
Primer R：5'-CCARATACCTACAACTGGCCATA-3' (23mer)

【PCR条件】
PCR grade water           　      　     　3.3μl
2×PCR buffer for KOD FX         　        15μl
2mM dNTPs                           　     　      6μl
Primer F (5pmol/μl）               　        1.8μl
Primer R (5pmol/μl)   　          　         1.8μl
KOD FX (1.0U/ ml)                 　     　   0.6μl
样品   　 　 　 　　 　　 　     　         1.5μl
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Total volume      　               　     　     30μl

【PCR循环】
94℃　2 min
(98℃　10 sec, 55℃　30 sec, 68℃　10 sec)×35cycles

其他公司产品按推荐的条件。

【结果】

【数据提供】
水产综合研究中心　东北区水产研究所
奥村 裕 老师

【来自老师的评语】
通常用A公司通用型酶（Taq Base）总是不能很顺利地进行PCR，测序时，使用A公司通用型酶 + B公司粗样品用PCR添加剂反应后再进行TA克隆。由于PCR添加剂粘性很高，用琼脂糖凝胶电泳确认没有问题，但如果PCR产物未经纯化用于DGGE时条带就会出现弥散，改变凝胶浓度、变性剂浓度也无法得到改善。

而使用KOD FX，无需抽提DNA即可进行PCR，且能顺利进行DGGE。看了公司网页上所述，使用ProK、SDS后的样品需要纯化，但不纯化直接PCR也能得到很好的结果。循环数一开始尝试了30个循环，但35个循环更好。此外，开始很担心GC发卡结构的引物能否顺利扩增，最终证明也没有问题，顺利地进行了PCR。