KOD FX
实验例31: 小鼠尾巴裂解液的基因组DNA的扩增

【样品】
实验 1) mouse tail lysed with Proteinase K 0.5μl
实验 2) Plasmid (20ng)

【目的片段】目的片段基因名、扩增片段大小
实验 1) pGKneo, 500 bp
实验 2) CAG promoter region + GFP, 3 kb

【目的片段序列】
实验 1) forward, reverse共に20 mer
实验 2) forward, 21 mer; reverse, 29 mer

【反应液组成】
●KOD FX
PCR grade water                　                          X μl
2x PCR buffer for KOD FX                             7.5 μl
2mM dNTPs                                                      3 μl
10pmol /μl Primer #1                                   0.45 μl
10pmol /μl Primer #2                                   0.45 μl
KOD FX (1.0U/μl)                                           0.3 μl　
样品 　 　 　　　　　　　          　　   　 Y μl
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Total reaction volume                                    15 μl 

※其他公司产品按其说明书推荐的条件。

【循环】
实验 1)
95℃ 2min
↓
(95℃ 30 sec, 56℃ 30 sec, 72℃ 30 sec) 36 cycles
↓
4 ℃, forever

实验 2)
95℃ 2 min
↓
(98℃ 10 sec, 60℃ 30 sec, 72℃ 3 min) 33 cycles
↓
4 ℃, forever

【数据提供】
高知大学医学部解剖学教研室
三井　真一　老师

【来自老师的评语】
 扩增效率超乎想象，非常吃惊。
 小鼠尾巴的处理如下：
在切成长度约3〜5 mm的小鼠尾巴中添加500 μl的Lysis buffer (100 mM Tris-Cl, pH8.5, 5 mM EDTA, 200 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 0.2% SDS, 100μg/ml Proteinase K)，56℃条件下放置一个晚上混合。将该溶解液的0.5 μl作为模板添加到反应液中。不进行Proteinase K失活操作。通过过夜处理使其自身分解失活。根据经验，添加过剩的液量、尾巴的溶解时间过短（几个小时；尾巴刚刚溶解不久）等，会出现条带不清晰的情况。

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