KOD FX
实验例32: 对病原酵母Cryptococcus neoformans菌体(菌落)的直接PCR

M：1kb DNA Ladder
1~5：Cryptococcus neoformans 菌株No.（1：Positive Control[野生型菌株]、2：Negative Control[基因缺损菌株]、3~5：基因互补菌株）

【样品】
病原酵母Cryptococcus neoformans菌体（菌落） 

【前处理】
无（直接使用菌落）

【目的片段】
任意的酶基因　1.8 kb

【引物】
20碱基（序列非公开）

【反应液组成】
KOD FX：Buffer 25 μl、2.5 mM dNTP 4μl、引物各10 pmol、KOD FX 1μl、加蒸馏水定容至50 μl。之后用牙签挑取菌体，放入反应液中少量悬浊。
A公司高效率PCR酶：Buffer 5μl、2.5 mM dNTP　4μl、引物各10 pmol、酶 0.2μl、蒸馏水定容至50 μl。

模板DNA使用C. neoformans菌落和抽提的DNA。使用菌落时，用牙签挑取放入反应液中少量悬浊。使用抽提的DNA时，添加1 μl。

【PCR 循环】
94℃ 5 min
↓
(94℃ 30 sec, 60℃ 30 sec, 72℃ 1.5 min) 30 cycles
↓
72℃ 5 min
↓
4℃ ∞

【结果】
尝试用KOD FX对C. neoformans 菌落进行直接PCR，所有的样品均可确认到扩增，而用A公司高效率PCR酶，则几乎确认不到扩增。另外，以抽提・纯化后的基因组DNA为模板进行PCR，则都可确认到扩增。

【数据提供】
千叶大学真菌医学研究中心 李皓曼 老师、清水 公德 老师

【来自老师的评语】
以前对Cryptococcus neoformans进行PCR扩增，需要进行磁珠破碎等烦杂的前处理，或者使用很贵的DNA抽提试剂盒来纯化DNA。使用KOD FX，可直接对菌体进行PCR。本实验后，又有好几位实验室的老师、学生以各种不同的基因为目的片段进行PCR实验，都取得了很好的结果。