对米曲菌(Aspergillus oryzae)直接PCR








【样品】
米曲菌 菌体(悬浊液)



【前处理】
悬浊(使用菌体)
<用移液器取适量霉菌、在TE Buffer中悬浊>




【目的片段】
Aspergillus oryzae amy gene for alpha-amylase 2.1 kb



【引物】
F: CCATGCTTGGAGGATAGCAA (Tm 58.7)
R: CACTGTCCAATGCCAGATTG (Tm 57.8 )



【反应液组成】
PCR grade water                                     7
PCR buffer for KOD FX                  25 (μl)
2 mM dNTPs                                           10
10 pmol/μl Primer F                                1
10 pmol/μl Primer R                               1
KOD FX (1.0 U/μl)                                 1    
霉菌悬浊液                        5
 Total                                                         50 





【PCR 循环】

94℃ 5 min

(98℃ 10 sec, 55℃ 30 sec, 68℃ 2 min) 35 cycles

4℃∞



※A公司高效率PCR酶使用其推荐条件。



【结果】
无需特别的前处理,即可得到良好的扩增。直接用霉菌的菌落也可进行扩增,但如果带入过量的菌落,则可能会影响到实验的可重复性。取适量霉菌,放到50 μl的TE Buffer中悬浊,取该悬浊液5 μl添加到KOD FX的PCR反应液(总反应体系50 μl)中,可到重复性良好的扩增。




 


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