KOD FX
实验例34: 对福尔马林固定石蜡包埋切片提取的DNA的分析

M: 100bp DNA Ladder
1: Proteinase K处理后、过柱纯化得到的DNA ①
2: Proteinase K处理后、经70℃10分钟处理的粗样品　②
3: DW
< 加样量：2μl / Lane>

【样品】
福尔马林固定石蜡包埋材料(人）
（本次使用的切片厚度约为10μm、大小约为1cm x 2cm）

【前处理】
将5~10μm石蜡包埋切片放入1.5ml离心管
↓
脱石蜡
加入二甲苯、静置5分钟后离心去除二甲苯
(重复3次）
↓
脱二甲苯
加入100%乙醇、静置5分钟后去除乙醇

(重复4次)
↓
去除乙醇后、70℃・5分钟完全除去乙醇
↓
加入10mM Tris-HCl (pH 8.0) 300μl后、加Proteinase K(10mg/ml) 10μl、37℃放置一晚

※在本实验中，添加了10mM Tris-HCl (pH 8.0) 300μl，根据样品量可在50〜300μl范围内使用。Proteinase K的量也请根据样品量作相应的增减。
※切片较大的情况下，添加buffer 后，用眼科用的镊子把切片分割成1mm以下后再添加Proteinase K。
※37℃放置一晚后，未消化的组织仍较多的情况下，再添加5〜10μl　的Proteinase K，消化2〜3小时。
※根据组织的细胞密度、种类等的不同，消化的情况也不一样。由于纤维组织无法被Proteinase K消化，因此含肌肉、膜等较多的组织不能完全溶解。

↓
加热处理(70℃、10 min)　⇒　直接作为PCR用样品使用②
↓
过柱纯化（使用硅石膜片的离心柱纯化）　⇒　作为DNA模板使用①

【目的片段】
Human β-globin　268bp

【引物】
Primer F:GAAGAGCCAAGGGCAGGTAC
Primer R:CAACTTCATCCACGTTCACC

参考文献：Am.J.Pathol. 154;67-75,1999

【反应液组成】

*以Proteinase K处理后的Lysate 1μl为基准添加。
纯化DNA的添加量以20μl反应体系约100ng为基准。由于组织量较少时，回收量也会变少，因此，要保证过柱纯化溶出的DNA能满足最低量，适量添加。添加量超过1μl时，要调整灭菌蒸馏水量。

【PCR 循环】

94℃ 15 min**
↓
(98℃ 10 sec, 57℃ 30sec, 68℃ 30sec)×38cycles

**福尔马林固定组织得到的DNA扩增，预变性步骤设定为7~15分分钟可得到良好的结果。

【数据提供】
福冈大学 医学部 病理学教研室
石黑　晶子 老师、竹下　盛重 老师、福重　智子 老师

【来自老师的评语】
用其他公司的聚合酶，即便使用纯化后的DNA，仍有很多样品无法扩增。而用KOD FX，无论是经纯化的DNA还是Proteinase K处理后的石蜡包埋材料的Lysate，均可得到高效率的PCR产物。组织较小时，如果再对其进行纯化，则DNA量会变少，因此不要纯化直接PCR较好。