KOD FX
实验例39: 用KOD FX通过菌落直接PCR检测各种细菌DNA

●　A.厌氧性肠内细菌的检测

●　B.代表性革兰氏阳性菌（Gram-positive bacteria）的检测

●　C.肠道出血性大肠杆菌O157与其他大肠杆菌的检测

【样品】

●实验A
厌氧性肠内细菌（Bacteroides fragilis ATCC25285, Bifidobacterium adolescentis GAI1275, Peptostreptococcus magnus GAI5528, Lactobacillus acidophilus GAI1132）的菌落
●实验B
Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Serratia marcescens, Salmonella enteritidis的菌落
●实验C
肠道出血性大肠杆菌的变异菌株GPU995、大肠杆菌K-12菌株的C600、临床分离菌株的大肠杆菌Nagoya的菌落



【样品的处理】



●实验A
用移液器的tip头取在厌氧罐内GAM培养基上繁殖的菌落，在PBS中悬浊，然后将该tip直接浸到反应液中悬浊。
●实验B
用微量移液器的tip头接触在LB培养基上繁殖的菌落，在PBS中悬浊，然后将该tip直接浸到PCR反应液中悬浊。
●实验C
用移液器的tip头取在LB培养基上繁殖的菌落，在反应液中悬浊。

【基因名・目的片段大小】

●实验A
ssu (16S rDNA基因),约1kb
●实验B
16S rDNA基因, 约1kb
●实验C
espA (TypeIII分泌装置的一部分), ssu (16S rDNA基因)、分别约600bp及约1kb 

【反应液组成】

●实验A
Buffer 10μL + dNTP 4μL + 水5μL + 引物0.3+0.3 μL(1.5 μM) + 酶 0.4μL
※A公司酶也是同样组成
●实验B
Buffer  10μL + dNTP 4μL + 水 5 μL + 引物 0.3 + 0.3μL (1.5 μM) + 酶 0.4μL
※A公司酶也是同样组成
●实验C
Buffer 10μL + dNTP 4μL + 水 4.8μL + 引物0.4 + 0.4μL (1.5 μM) +酶 0.4μL
※A公司酶也是同样组成

【PCR循环】

96℃, 2 min
↓
（95℃ 30sec,   50℃  30sec,   72℃ 1min) × 40 cycles
※A公司PCR酶也用同样循环





【评语・意见等】

●实验A
根据菌种的不同PCR的结果有差异，但用KOD FX可高效率地扩增。

●实验B
无论用哪个酶都可扩增，但用KOD FX扩增效率更好。扩增Serratia marcescens菌不容易产生弥散，特异性条带非常清晰。

●实验C
可以区分O157与其他大肠杆菌。无论哪个酶都可以扩增，但似乎KOD FX的特异性更高些。

【数据提供】

岐阜药科大学微生物学研究室
吉田朋未、高桥圭太、后藤麻美、杉山刚志 老师