KOD FX
实验例42:用KOD FX对植物叶进行迅速的DNA扩增

  ＜用乳棒粉碎叶子样品＞

*Buffer A:
  100mM Tris-HCl(pH9.5)
  1M KCl
  10mM EDTA　

＜结果＞

【背景】
   实验例集中所记载的通过95℃10分钟加热的方法中，无法看到DNA的扩增。在这里，通过用乳棒粉碎叶子，从少量的样品中简易地抽提DNA，进行高效率的PCR。

【样品】 稻以及竹类的叶子

【样品的处理】 
抽提液与实验例集中记载的 Buffer A相同。如实验例集中所记载的，用剪刀剪3mm大小的植物叶，置入离心管，添加 Buffer A 100μl。用乳棒粉碎叶子直到Buffer变绿色为止。然后，进行简单的spin down，取上清1μl进行PCR(50μl)。

【基因名】 gibberellin 20-oxidase gene

【目的片段长度】 1686 bp

【反应液组成】 KOD FX 说明书中所记载的反应条件

【PCR循环】 35循环

【引物序列】
forward primer: 5’-ATGCGGTGCAACTGCTACCC-3’
reverse primer : 5’-TATACCTCCCGTTCGACAGC-3’
※以稻叶基因的DNA序列为基础作成

【PCR循环】
＜3 Step cycle＞
94℃, 2 min.→［98℃, 10 sec.→60℃, 30 sec.→68℃, 1 min.］(35 cycles)→68℃, 7 min.

＜2　Step cycle＞
94℃, 2 min.→［98℃, 10 sec.→68℃, 1min.］(35 cycles)→68℃, 7 min.

【结果】
用乳棒粉碎的方法，无论哪个样品都能确认到DNA扩增。PCR反应三步法（退火温度60℃）和两步法进行比较，虽然两步法的扩增效率不如三步法，但仍可确认到DNA的扩增。
实验例集中，对叶绿体DNA的扩增，由于拷贝数较多，进行加热处理后仍可扩增，但不适用于基因组DNA的扩增。在本实验中，通过乳棒粉碎得到的粗抽提液可顺利地扩增。另外，实验例集中记载着引物设计得长些为好，在本实验中，20-mer的引物长度也可顺利地进行PCR反应。

【评语・意见等】
过去，作为PCR反应模板使用的DNA，需要通过液氮粉碎，然后必须进行抽提处理，操作烦杂非常耗时间。因此，配制样品要花很多人工，而用乳棒粉碎的方法，一个样品只需几秒钟时间，即便样品很多仍能简便地进行PCR。如果只是PCR的话，只要以用本实验所述简易抽提法得到的抽提液为模板，用 KOD FX 即可得到充分的反应。与过去的DNA抽提操作相比，可大幅节省时间和劳动力。

【数据提供】
京都大学研究生院 农学研究科 地域环境科学专业
生物环境科学教研室 森林生化学领域
坂本 正弘 老师