KOD FX
实验例43: 通过鳉鱼幼鱼的基因判断其性别的方法

【样品】绯青鳉 (Oryzias latipes) 成鱼的雄性、雌性以及幼鱼（性别不明）

【样品处理】

(1) 把青鳉鱼放入带冰的培养皿，放置1−2分钟。
(2) 用剪刀和镊子剪取尾鳍约50mg，放入生物体样品破坏器具（BioMasher; NIPPI公司）中。
(3) 在该容器中添加50 μL的phosphate-buffered saline [8.1 mM Na2HPO4, 1.5 mM KH2PO4, 2.7 mM KCl, 137 mM NaCl (pH 7.4)]，离心机，15000×gで，离心10～30秒。
(4) 对通过离心破碎的样品溶液中的DNA进行PCR扩增。
(5)对 PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据条带确定幼鱼性别。
※鳉鱼的鳍约两周后会重新长出来。

【基因名】
・DMY（DM domain gene on the Y chromosome）基因
・DMRT1（DM-related transcription factor 1）

【目的片段】
雌：DMRT1 (1,300 bp)
雄：DMRT1 (1,300 bp) ＋ DMY (1,000 bp)

【引物序列】
DMY F： 　5’CCGGGTGCCCAAGTGCTCCCGCTG3’
DMY R： 　5’GATCGTCCCTCCACAGAGAAGAGA3’

【反应条件】
DW                                        6
2XBuffer                             25
2mM dNTPs                      10
10 pmol/ml  Primer F         1.5
10 pmol/ml  Primer R        1.5
KOD FX                                 1 
Sample                                 5　　
　　　　　　　　　　       50 μL

【PCR循环】
Taq DNA polymerase ：
94℃, 2 min.
(94 ℃,  1 min.,  55 ℃, 1min., 72℃, 1 min.) ×30 cycles
72℃, 7min.

KOD FX：
94℃, 2 min.
(98℃, 10 sec., 55℃, 30 sec.,68℃, 1 min.) ×30 cycles
68℃, 5 min.

【评语・意见等】
　 作为学习DNA个体差的实验，在大学的实习中，通常使用实验者自己的细胞。但在以高中生为对象的实验中，需要让他们充分意识到DNA作为个人信息的重要性再进行实验。同时，即便实验的环境很完备，DNA的抽提・扩增仍需要花很多时间，这对有时间限制的实习而言是很大的障碍。
　 在本研究中，作为学习DNA个体差的实验，以性决定基因非常明确的鳉鱼为材料，可简单地判断从外部形态无法判断雌雄的幼鱼的性别。本实验中，DNA 抽提使用生物体破坏器具BioMasher（NIPPI公司），DNA扩增用KOD FX（东洋纺公司）进行PCR，大幅缩短了时间并降低了成本，可实现短时间（3小时以内）且低成本的实习。用以前的方法，需要进行DNA 的纯化，而在本实验中，无需纯化，将生物体样品破坏后的抽提液直接用于PCR，主要是得益于KOD FX DNA polymerase的DNA高扩增效率（缩短30~40分钟）。
  本次新开发的鳉鱼幼鱼性别判断方法，无需特别的器具及试剂盒，可在短时间内简便地进行，同时不涉及到个人信息，可在高中或大学初期教育等未成年人较多的机构，开始进行DNA鉴定、基因多型学习时用。

【数据提供】
东邦大学　药学部　实验部门
西口 庆一　老师